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五步教你跑出漂亮的大分子western-blot圖訣竅

       如果你的蛋白分子量大于150KD,但苦于一直跑不出好看的western-blot,那么這篇文章,你一定得看。

       選對凝膠很重要
       3種常見的凝膠包括Tris-Glycine, Bis-Tris and Tris-Acetate. Tris-Glycine凝膠的PH為8.6,且保質期很短。在跑膠的過程中,PH還有上升的趨勢,可達到9.5。這會導致蛋白降解和低分辨率。
       Bis-Tris凝膠的PH為6.4,相對Tris-Glycine凝膠,穩定性和保質期都有所增加。但這種凝膠需要在溶液中增加抗氧化劑,比如DTT,以維持蛋白的還原性。
       Tris-Acetate 凝膠的PH為7,跑大分子蛋白會呈現很高的分辨率。 跑大分子蛋白時,我們推薦使用Tris-Acetate 凝膠。

       凝膠濃度很重要
       既然選擇了Tris-Acetate 凝膠,還有幾個要考慮的問題。凝膠濃度與孔徑成反比:濃度越小,孔越大。較大的蛋白質容易通過較大的孔,所以我建議使用低百分比的凝膠,如7%。可以使用梯度凝膠或非梯度凝膠,梯度凝膠適合新樣本。

       提高轉移buffer中的SDS,減少甲醇
       轉移buffer的組成至關重要。如果有甲醇存在,大分子蛋白很容易沉淀。通過減少轉移buffer中的甲醇百分比(10%或低)來避免這種情況發生。 為了進一步確保蛋白質不會沉淀,考慮添加SDS至終濃度為0.1%。SDS向蛋白添加均勻的負電荷,使得它們容易從凝膠轉移到膜上。

       選擇合適的膜
       膜一般有PVDF膜或NC膜。跑大分子蛋白選擇PVDF膜。如前面所說,如果有甲醇存在,大分子蛋白很容易沉淀。而PVDF膜不需要在轉移buffer中添加甲醇,目的蛋白轉印的機會高。兩種類型的膜都有各種孔徑尺寸,常見的是0.2um和0.45um。與凝膠一樣,較大的蛋白比較小的容易穿過大孔隙。大多數蛋白質(> 20kDa)可以用0.45um膜轉移,避免使用0.2um孔徑。

       增加轉印時間
       在正確的選擇完凝膠、轉印膜及轉移buffer后,轉印正式開始。半干轉快且方便,但不適用于大分子蛋白。我建議濕轉,因為大分子蛋白轉移時間很慢,推薦350-400 mA轉移90min或 4°C,40 mA,轉印過夜。